Σήμερα, οι μετρήσεις είναι πλήρως αυτοματοποιημένες παρέχοντας  ακριβή και επαναλήψιμα αποτελέσματα. Η τελικής όμως διάγνωση τίθεται από τη μικροσκοπική εξέταση των επιστρώσεων του περιφερικού αίματος.Η γενική αίματος είναι η πιο κοινή εξέταση που χρησιμοποιείται στην ιατρική πράξη. Παρέχει πληροφορίες για τα έμμορφα στοιχεία του αίματος WBC (Λευκά), RBC (Ερυθρά) και PLT (Αιμοπετάλια). Είναι ο συνδυασμός μέτρησης & παρατήρησης ( μικροσκόπησης).

Η γενική αίματος ενδείκνυται:

 

  • Εξέταση ρουτίνας
  • Προεγχειρητικός έλεγχος (ικανοποιητική μεταφορά οξυγόνου, αιμόσταση)
  • Λοιμώξεις
  • Διερεύνηση αναιμίας –Παρακολούθηση αγωγής
  • Διερεύνηση αιμορραγικής διάθεσης
  • Διερεύνηση κακοήθων νοσημάτων αίματος (λευχαιμίες, ΜΔΣ, ΜΥΝ, πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες)
  • Αποτελέσματα και επιπτώσεις χημειοθεραπείας και ακτινοβολίας

 

 

Αντιπηκτικά – Αιμοληψία

Το αντιπηκτικό εκλογής για τη μέτρηση των εμμόρφων στοιχείων του αίματος είναι ένα από τα άλατα του EDTA ( αιθυλενο-διαμινο-τετραοξεικό οξύ) το οποίο όταν βρίσκεται σε άριστη συγκέντρωση στο δείγμα, δεν επηρεάζει τον αριθμό των κυττάρων και το μέγεθός τους και εμποδίζει τη συσσώρευση των αιμοπεταλίων. Το K2EDTA χρησιμοποιείται συχνότερα διότι είναι πιο ευδιάλυτο, αν και υπάρχουν ενδείξεις ότι η τρικαλιούχος μορφή (K3EDTA) είναι καλύτερος χηλικός παράγοντας. Το Βρετανικό Ινστιτούτο Προτυποποίησης συνιστά αναλογία K2EDTA προς αίμα 1.5±0.25mg/mL. Οι ποσοτικοί προσδιορισμοί όπως η αρίθμηση των κυττάρων του αίματος, πρέπει να εκτελούνται μέσα σε 6 ώρες από την αιμοληψία και το αίμα που πρόκειται να αναλυθεί πρέπει να συντηρείται στους 4-8οC  στο χρονικό διάστημα ανάμεσα στην αιμοληψία και την ανάλυσή του. Κακή τεχνική αιμοληψίας (εργώδης) ή κακή ανάδευση, σχετίζεται με παραγωγή πηγμάτων ή μικροθρόμβων (ψευδοθρομβοπενία), αιμόλυση, ή ψευδοαναιμία. Η είσοδος οινοπνεύματος στο δείγμα προκαλεί αιμόλυση.

Σταθμός της ιστορίας των αιματολογικών αναλυτών

Ένας μηχανολόγος από το Αρκάνσας έκανε την ανακάλυψη που θα οδηγούσε στην εποχή των αυτόματων αιματολογικών μετρήσεων. Το 1949 ο Wallace Η. Coulter συνέλαβε την ομώ­νυμη αρχή ηλεκτρονικής μέτρησης μικροσκοπικών σωματιδίων που περιλάμβανε και τα έμμορφα στοιχεία του αίματος. Η βασική ιδέα ήταν ότι τα κύτταρα του αίματος, ως κακοί αγωγοί του ηλεκτρισμού, περνώντας ένα- ένα εναιωρημένα σε φυσιολογικό ορό από μια μικροσκοπική οπή θα ανιχνεύονταν από τη μεταβολή της ηλεκτρικής αντίστασης (impedance) με την εφαρμογή ενός σταθερού δυναμικού στα άκρα της οπής.

 

Αρχές – Μέθοδοι ανάλυσης των αιματολογικών αναλυτών

Οι αρχές και οι μέθοδοι ανάλυσης των αιματολογικών αναλυτών είναι:

•          Μεταβολή ηλεκτρικής αντίστασης οπής (aperture impedance)

•          Αρχή σκεδασμού ακτίνας φωτός (light-scatter)

•          Κυτταροχημεία ροής

•          Κυτταρομετρία φθορισμού (φθοριοχρώματα)

 

Μεταβολή ηλεκτρικής αντίστασης οπής (aperture impedance)

Η διέλευση του κυττάρου από την οπή συνεπάγεται τη διακοπή της ροής ρεύματος με αποτέλεσμα τη μεταβολή του δυναμικού. Αυτό έκφραζεται σε παλμό.

Ένας παλμός = ένα κύτταρο     Ύψος παλμού = όγκος κυττάρου

 

 

Αρχή αγωγιμότητας (Conductivity)

Σκεδασμός ακτίνας φωτός (light-scatter)

Κυτταροχημεία ροής

 

Κυτταρομετρία φθορισμού (φθοριοχρώματα)

Κοινές παράμετροι όλων των αιματολογικών αναλυτών

Ερυθρά

Λευκά

Αιμοπετάλια

RBC

WBC

PLT

Hb

%NEUT     #NEUT

MPV

Hct

%LYMPH   #LYMPH

PCT

MCV

%MONO   #MONO

PDW

MCH

%EOS       #EOS

 

MCHC

%BASO    #BASO

 

RDW

 

 

 

Παράμετροι με ιδιαίτερη διαγνωστική τους αξία που εισήχθησαν στους αιματολογικούς αναλυτές

 

Παράμετροι ερυθρών

•          CHCM (Corpuscular Hemoglobin Concentration Mean)

•          CH (Corpuscular Hemoglobin content)

•          HDW (Hemoglobin concentration Distribution Width)

•          %MICRO ποσοστό ερυθρών επί τοις % με όγκο < 60 fL

•          %MACRO ποσοστό ερυθρών επί τοις % με όγκο > 120 fL

•          %HYPO ποσοστό ερυθρών επί τοις % με Hb < 28 g/dL

•          %HYPER ποσοστό ερυθρών επί τοις % με Hb > 41 g/dL

Παράμετροι λευκής σειράς

Άωρα κύτταρα της κοκκιώδους σειράς IG (Immature Grannulocytes)

Περιλαμβάνει τα μυελοκύτταρα και τα μεταμυελοκύτταρα  και παρέχεται από τον αναλυτή ΧΕ-2100 (Sysmex).

Άωρα κύτταρα της μυελικής σειράς (Hemopoietic Progenitor Cells, HPC)

Χρησιμοποιώντας τα ηλεκτρονικά σήματα RF/DC ο αναλυτής ΧΕ-2100 παρέχει τον πληθυσμό των άωρων κυττάρων της μυελικής σειράς HPC.

Παράμετροι αιμοπεταλίων

Κλάσμα των αώρων αιμοπεταλίων (Immature Platelets Fraction)

Το κλάσμα των αώρων αιμοπεταλίων (Immature Platelets Fraction, IPF) αποτελείται από νεαρά αιμοπετάλια με άφθονο RNA. Προσδιορίζονται με τη χρήση πολυμεθίνης σε ορισμένους αναλυτές της εταιρείας Sysmex.   Η μέση τιμή και το εύρος των φυσιολογικών τιμών του IPF είναι 3.4% και 1.1-6.1% αντίστοιχα. Στην αυτοάνοση θρομβοπενική πορφύρα οι τιμές είναι αυξημένες με μέση τιμή 22.3% και εύρος 9.2-48.3%.

Ποσοστό εμπυρήνων ερυθροκυττάρων

Η μέτρηση των εμπυρήνων ερυθρών με φθορισμό στους αιματολογικούς αναλυτές  βασίζεται στη χρήση ειδικών λυτικών αντιδραστηρίων τα οποία ενώ προσβάλλουν σε μικρό βαθμό τα λευκά έτσι ώστε να διατηρείται το μέγεθός τους, μετατρέπουν τα εμπύρηνα ερυθρά σε γυμνούς πυρήνες και αιμολύουν τα ερυθρά. Η μέτρηση των ερυθροβλαστών επιτυγχάνεται με τη χρήση φθορίζουσας χρωστικής πολυμεθίνης. Η χρωστική βάφει εντονότερα τα λευκά από τους ερυθροβλάστες οι οποίοι διαχωρίζονται στο κυτταρόγραμμα φθορισμού και πρόσθιου σκεδασμού. Οι προερυθροβλάστες ξεχωρίζουν λόγω του μεγαλύτερου σήματος πρόσθιου σκεδασμού.

Μέτρηση των ΔΕΚ

Για τη μέτρηση των ΔΕΚ χρησιμοποιούνται οι αρχές της κυτταροχημείας ροής και της κυτταρομετρίας φθορισμού (φθοριοχρώματα).

Παράμετροι Δικτυοερυθροκυττάρων (ΔΕΚ) (ADVIA 120 / 2120)

Σύμβολο

Ονομασία

Μέτρηση

%RETIC

%Reticulocytes

100 x (RETIC Count)  x % Retic Cal Factor                                        

#RETIC

#Reticulocytes

RBC x (%Retic ÷ 100) 

MCVr

Mean Cell Volume population reticulocytes

Mean of the RETIC Volume histogram for the reticulocyte 

CHr

Cellular Hemoglobin population content reticulocytes

Mean of the RETIC CH histogram for the reticulocyte

CHCMr

Cell Hemoglobin         Concentration Mean reticulocytes)

Mean of the Retic HC histogram for the reticulocyte population

IRF-H

Immature Reticulocytes  Fraction High

100 x (#HRetic ÷ RETIC Count)

IRF-M+H

Immature Reticulocytes  Fraction Medium + High

100 x ([#HRetic + #MRetic] ÷ RETIC Count)

Στην τεχνολογία της Sysmex ο βαθμός ωριμότητας των ΔΕΚ αντί να εκφραστεί με μία παράμετρο καθορίστηκε με την ποσοστιαία έκφραση τριών δικτυοερυθροκυτταρικών πληθυσμών με διαφορετική ωριμότητα. Η περιοχή του φθορισμού των ΔΕΚ διαιρέθηκε σε τρία ίσα τμήματα. Το επί τοις % ποσοστό επί του συνόλου των ΔΕΚ  του δείγματος στις τρεις αυτές καθόριζε τα ΔΕΚ χαμηλού φθορισμού LFR (Low Fluorescence Ratio), μέσου φθορισμού MFR (Median Fluorescence Ratio) και υψηλού φθορισμού HFR (High Fluorescence Ratio). Μια κοινά αποδεκτή παράμετρος ορίστηκε το κλάσμα των αώρων ΔΕΚ, IRF (immature Reticulocyte Fraction), Στην τεχνολογία Sysmex ο δείκτης IRF παρέχεται από το άθροισμα MFR+HFR και στην τεχνολογία ADVIA με το άθροισμα Μ+Η.

Μέτρηση δείγματος μυελού των οστών σε αιματολογικό αναλυτή

Η ορολογία που χρησιμοποιήθηκε από τον G d’ Onofrio  για το δείγμα μυελού το οποίο μετρείται σε αιματολογικό αναλυτή ήταν “bone marrow fluid”. Ο αριθμός των κυττάρων σχετίζεται με την κυτταροβρίθεια του μυελού και προσδιορίζεται εύκολα ανάλογα της λευκής προς την ερυθρά σειρά.

 

Σφάλματα αναλυτών

Με τον όρο σφάλμα (error) εννοούμε απώλεια της αξιοπιστίας των αποτελε­σμάτων που δεν οφείλεται σε κάποιο λάθος. Τα σφάλματα διακρίνονται σε συστηματικά και σε τυχαία. Η απορρύθμιση ενός αιματολογικού αναλυτή και η αναλυτική μεροληψία είναι κλασικό παράδειγμα συστηματικού σφάλματος που επηρεάζει την ορθότητα των μετρήσεων και επιδέχεται διόρθωση η οποία γίνεται με τη ρύθμι­ση του αναλυτή. Τα τυχαία σφάλματα οφείλονται συνήθως σε τεχνικά προβλήματα τα οποία παραβλάπτουν την ακρίβεια των μετρήσεων.

Τα κυριότερα σφάλματα που επιδρούν στις ερυθροκυτταρικές παραμέτρους και οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος

ΑΙΤΙΟ

ΕΡΥΘΡΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΠΑΡΑΜΕΤΡΟΣ ΠΟΥ ΕΠΗΡΕΑΖΕΤΑΙ

παραπρωτείναιμία

Hb­  MCH­  MCHC­

υπετριγλυκαιριδαιμία

Hb­  MCH­  MCHC­

υπερλευκοκυττάρωση

Hb­  RBC­  Hct­  MCV­  MCH­

ψυχροσυγκολλητίνες

RBC¯  Hct¯  MCV­  MCH­  MCHC­

αιμόλυοη

Hb¯  Hct¯  RBC¯

υπερ οσμωτικότητα

Hct­  MCV­  MCHC¯

έντονη μικροκυττάρωοη

RBC¯  Hct¯  MCV­  MCH­  MCHC­

υποχρωμία

Hct¯  MCV¯  MCHC­

υπερχρωμία

Hct­  MCV­  MCHC¯

Aίτια παρεμβολών στις μετρήσεις των ΔΕΚ στους αιματολογικούς αναλυτές

Λευκοκυττάρωση (ειδικά λεμφοκυτττάρωοη)

Σωμάτια Heinz

θραύσματα λευκών (λευχαιμίες)

HbS, HbH, ασταθείς αιμοσφαιρίνες

Εμπύρηνα ερυθρά

Παράσιτα ελονοσίας

θρομβοκυττάρωση

Παράσιτα Babesiosis

Γιγαντιαία αιμοπετάλια

Πορφυρία (αυξημένος φθορισμός ερυθρών)

Συκρίμματα αιμοπεταλίων

Παραπρωτεϊναιμία

Συγκόλληση ερυθρών

Κρυοσφαιρίνες

Βασεόφιλη στίξη

Αιμόλυση, ψυχροσυγκολλητίνες

Σωμάτια Howwell – Jolly

Φθορίζουσες ουσίες (φλουοροανγειογραφία)

Τα κυριότερα σφάλματα που επιδρούν στις λευκοκυτταρικές μετρήσεις που οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος

ΛΕΥΚΑ ΨΕΥΔΩΣ ΑΥΞΗΜΕΝΑ

ΛΕΥΚΑ ΨΕΥΔΩΣ ΕΛΑΤΤΩΜΕΝΑ

εμπύρηνα ερυθρά

κυτταρική λύση

ερυθρά ανθεκτικά στα λυτικά

παλαιό δείγμα

συγκρίμματα αιμοπεταλίων

Β-ΧΛΛ

λιποσταγονίδια

ουραιμία

γιγάντια αιμοπετάλια

φάρμακα (κυκλοφωσφαμίδη)

ηπαρίνη

συγκόλληση

ινική

αντισώματα

κρυοσφαιρίνες

βλέννα

πλασμώδια

μικροπήγματα

Εσφαλμένη αύξηση ή μείωση στη μέτρηση των αιμοπεταλίων που οφείλονται σε κάποια ανωμαλία του δείγματος

ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ ΨΕΥΔΩΣ ΑΥΞΗΜΕΝΑ

ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΑ ΨΕΥΔΩΣ ΜΕΙΩΜΕΝΑ

παρεμβολή μικροσφαιροκυττάρων σε μαζικά εγκαύματα

μεγάλα αιμοπετάλια (Ιδιοπαθής θρομβοπενική πορφύρα, συγγενείς μακροθρομβοπενίες)

παρεμβολή μικροποικιλοκυττάρων σε θαλασσαιμία (ειδικά HbΗ)

συγκρίμματα λόγω συγκολλητινών εξαρτωμένων από αντιπηκτικά (κυρίως EDTA)

παρεμβολή θραυσμάτων λευκών (οξεία μονοκυτταρική λευχαιμία, λεμφώματα τριχωτή λευχαιμία)

συγκρίμματα λόγω ψυχροσυγκολλητινών μη εξαρτωμένων από αντιπηκτικά

βακτηριαιμία

δορυφορισμός αιμοπεταλίων στα λευκά κακή τεχνική – μικροπήγματα

(κακή αιμοληψία ή υπερπλήρωση φιαλιδίων)

εκσεσημασμένη λιπαιμία

αντιαιμοπεταλιακά αντισώματα σε συνάρτηση με ρευματοειδή παράγοντα παραπρωτεϊναιμία κρυοσφαιριναιμία

κρυοσφαιριναιμία με σχηματισμό μικροκρυστάλλων

DDAVP δια μέσου EDTA σε ασθενείς με τύπο IIB ν. Willebrand

σωμάτια Pappenheimer

χιμαιρικά θεραπευτικά αντιαιμοπεταλιακά

υποκατάστατα αίματος 2ης γενεάς

αντισώματα (abciximab) δια μέσου EDTA

 

Αυτοματισμός στο αιματολογικό εργαστήριο

Ο αυτοματισμός στο αιματολογικό εργαστήριο σημαίνει ταχύτατη παραγωγή αποτελεσμάτων και διαφυγή αναξιόπιστων αποτελεσμάτων. Η διασφάλιση ποιότητας (quality assuarance) σημαίνει πρόληψη σφαλμάτων ή λαθών και με έλεγχο ποιότητας (quality control) γίνεται η ανίχνευση των σφαλμάτων ή λαθών. Η διασφάλιση της ποιότητας γίνεται στην προαναλυτική φάση, στην αναλυτική και στη μετααναλυτική φάση.

Η διασφάλιση ποιότητας της αναλυτικής φάσης επιτυγχάνεται με τον εσωτερικό ποιοτικό έλεγχο (Internal quality control, IQC) και τον εξωτερικό ποιοτικό έλεγχο (External quality assessment scheme, EQAS). Ο εσωτερικός ποιοτικός έλεγχος είναι καθημερινός έλεγχος των αναλυτών με δείγματα ελέγχου (controls) και μέτρηση μερικών ίδιων δειγμάτων σε παρόμοιας τεχνολογίας αιματολογικών αναλυτών του εργαστηρίου.

Επίλογος

Η σημασία των αυτόματων αιματολογικών αναλυτών είναι εξαιρετικά σημαντική διότι έχουμε γρήγορα και αξιόπιστα αποτελέσματα. Ο γιατρός που εγκρίνει το αποτέλεσμα μιας γενικής αίματος πρέπει να γνωρίζει πολύ καλά τα τεχνικά χαρακτηριστικά του αναλυτή και να μπορεί να διορθώνει τα τυχόν σφάλματα. Τη σφραγίδα της τελικής αιματολογικής διάγνωσης πρέπει πάντα να βάζει η μικροσκόπιση του περιφερικού αίματος.

 

Βιβλιογραφία

  1. Πατεράκης Γ. Αιματολογικοί αναλυτές και βήματα για την κατανόησή τους. Αθήνα 2006
  2. Πατεράκης Γ. Κατ’ όγκον ανάλυση των σωματιδίων του αίματος με ηλεκτρονικό υπολογιστή.- Αξιολόγηση στο εργαστήριο και κλινική σημασία. Εκδόσεις Καρλαύτη, Αθήνα 1984
  3. Πατεράκης Γ. Αυτοματισμός στις μετρήσεις των εμμόρφων στοιχείων του αίματος. Στο βιβλίο των Ν. Βοργιά και Ν. Λαουτάρη «Αιματολογία» Εκδόσεις Αργυρός, 1991
  4. Paterakis G. Reticulocyte counting in thalassaemia. Clin Lab Haem, 18(Suppl 1) 17-28, 1996
  5. Davis BH, Davis KT, Tournier E, Becker K. Automated nucleated RBC counting comparison to flow cytometry. XVIII International Symposium on Technological Innovation in Laboratory Hematology, abstr 54, 2005
  6. G. d’Onofrio, G. Zini, M. Tommasi, L. Laurenti, L. Van Hove, S. Sica, G. Leone
  7. Automated analysis of bone marrow: Routine implementation and differences from peripheral blood. Laboratory Hematology 4:71–79, 1998
  8. Γ. Πατεράκης Γ. Σφάλματα ερυθροκυτταρικών παραμέτρων με τους αυτόματους αιματολογικούς αναλυτές – Πειραματική διερεύνηση. Διδακτορική διατριβή Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Αθηνών 1993
  9. Καρακάντζα Μ, Θεοδωρή Ε, Σακελλαρόπουλος Γ, και συν. Τμήμα ΕΑΕ εργαστηριακών μεθόδων προτυποποίησης και ελέγχου ποιότητας. Α. Αποτελέσματα ελέγχου ποιότητας ηενικής αίματος. Haema , 3 sup 1, 239-240, 2000
  10. Brugnara C, Hipp MJ, Irving PJ, Lathrop H, Lee PA, Minchello EM, Winkelman J: Automated reticulocyte counting and measurement of reticulocyte cellular indices. Evaluation of the Miles H*3 blood analyzer. Am J Clin Pathol 102:623, 1994
  11. Paterakis G, Lykopoulou L, Papassotiriou J, Stamulakatou A, Kattamis C, Loukopoulos D. Flow Cytometric analysis of reticulocytes in cord blood. Acta Hematologica, 90:182-5, 1993
  12. Πατεράκης Γ. Νέοι δείκτες της γενικής αίματος στη διάγνωση της λειτουργικής σιδηροπενίας. Στο Μαρινάκης Θ, Πατεράκης Γ, Σιδηροπενική Αναιμία , Σεμινάριο 28ου Πανελληνίου Ιατρικού Συνεδρίου, Εκδόσεις Τεχνόγραμμα 68-83, Αθήνα 2002
  13. Γ. Πατεράκης. Η κυτταρομετρία ροής του δικτυοερυθροκυττάρου. Από την έρευνα στην κλινική πράξη του αιματολογικού εργαστηρίου. Α΄Βραβείο, Συμβουλίδειο αγώνισμα μονογραφίας Ιατρικής Εταιρείας Αθηνών, Αρχεία Ελληνικής Ιατρικής, Τόμος 11, Συμπληρωματικό τεύχος Α, 1994.
  14. Λαουτάρης Ν. Ωφέλειες για το σύγχρονο κλινικό και εργαστηριακό γιατρό από τις νεότερες εξελίξεις στους αυτόματους αναλυτές αίματος. Στο υπό Μαρινάκη Θ και Πατεράκη Γ. Καθημερινές Εφαρμογές των Σύγχρονων Εργαστηριακών Εξελίξεων,  Ιατρική Εταιρεία Αθηνών, Εκδ. Τεχνόγραμμα 2003

 

 

 

 

Αλεξάνδρα Σταμουλακάτου

 


Διευθύντρια Αιματολογικού εργαστηρίου Νοσοκομείου Παίδων «Η Αγία Σοφία»